Teses e Dissertações

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Navegando Teses e Dissertações por Departamento "Campus Batalha"

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    Avaliação da atividade e da inibição de ureases: estudos biofísicos de interação e desenvolvimento de metodologias analíticas
    (2022-12-19) Tavares, Maria Celia; Santos, Josué Carinhanha Caldas; http://lattes.cnpq.br/3735618604163061; Carrilho, Emanuel; http://lattes.cnpq.br/9157872297410868; Santana, Rodolfo de Melo Magalhães; http://lattes.cnpq.br/2427465793815991; Cunha, Silvio do Desterro; http://lattes.cnpq.br/5661286013847300; Goulart, Marilia Oliveira Fonseca; http://lattes.cnpq.br/5271094336884473
    A urease catalisa a hidrólise da ureia em NH3(g) e CO2(g), e está associada a problemas na agricultura como redução da eficiência do fertilizante ureia, e na saúde, pois proporciona um microambiente favorável à colonização do estômago humano pela bactéria H. pylori. Logo, é importante inibir e determinar a atividade da urease em diferentes matrizes. Assim, esse trabalho tem como objetivo principal avaliar o mecanismo de inibição da urease por compostos orgânicos (naturais e sintéticos) empregando estudos biofísicos, bem como desenvolver metodologias para a determinar a atividade das ureases de solos e saliva (sintética e humana), além de avaliar potenciais inibidores. Para o trabalho de interação da urease com isotiocianato natural (MFC) foi obtido IC50 = 487 M e classificação de inibidor misto pelo ensaio de cinética clássica e de fluorescência sincronizada. Estudos espectroscópicos indicaram alterações conformacionais da enzima decorrentes da interação MFC-urease, com constante de ligação (Kb) igual a 1,80×102 L mol-1 e estequiometria 1:1. Além disso, foi comprovado a formação de ditiocarbamatos e tioureias correspondentes após a reação do MFC com aminoácidos contendo grupos tiol e amina/guanidina. Assim, o mecanismo de inibição da urease pelo MFC ocorreu por meio de interações covalentes e não-covalentes. O MFC foi mais efetivo na microbiota do solo do que in vitro, com inibição equivalente ao NBPT para os solos avaliados. Para a interação da urease com cinco benzoiltioureias, foi constatado relação direta com o tamanho da cadeia do substituinte N-alquílica com os valores de IC50 (M) e Kb. Verificou-se que a BTU1 foi o composto mais ativo e, por isso, selecionada para estudos biofísico e em solos com a urease. Para o complexo BTU1-urease, Kb foi na ordem de 103 L mol-1 nas diferentes temperaturas avaliadas; baseado nos estudos termodinâmicos a estabilização do complexo urease-BTU1 é preferencialmente por ligações de hidrogênio e forças de van der Waals. Os estudos de fluorescência sincronizada e ensaio de competição indicaram comportamento clássico de inibidor misto para BTU1. Nos diferentes solos avaliados, BTU1 apresentou potencial de inibição equivalente ao NBPT ressaltando a importância de ensaios in vitro e aplicação em amostra real para a seleção de um potencial inibidor. Além disso, foram desenvolvidos dois dispositivos analíticos em papel (UrePAD e Multicolor PAD) para determinar a atividade da urease em solos, saliva e na avaliação de inibidores. O UrePAD é baseado na mudança de cor do indicador ácido-base vermelho de fenol, em função do aumento do pH pela hidrólise da ureia pela urease. O Multicolor PAD também é um dispositivo colorimétrico, no qual foram avaliados cinco indicadores ácido-base (vermelho de fenol, azul de bromotimol, roxo de bromocresol, roxo de m-cresol e vermelho neutro) e papel com superfície modificada por polieletrólito poli- 4-estireno sulfonato de sódio ou polivinilpirrolidona. As imagens obtidas foram digitalizadas em um scanner de bancada, e a análise realizada no software Corel Draw X8. Os métodos apresentaram LOD médio de 0,10 U mL-1 com linearidade entre 0,25 e 4,0 U mL-1. Ambos os dispositivos foram aplicados na determinação da atividade da urease em quatro amostras de solos com diferentes características e avaliação in vitro de inibidores clássicos. Os resultados obtidos não diferiram estatisticamente (95% de confiança) do método de referência do azul de indofenol, tendo como vantagens o baixo custo, reduzido volume dos reagentes/amostra aliado à simplicidade e portabilidade, mostrando a capacidade de simplificar a determinação da atividade da urease em solos e a avaliação de potenciais inibidores. Por fim, o Multicolor PAD foi aplicado para determinar urease em amostra de saliva sintética e saliva humana, com recuperações quantitativas (ente 80 – 120%) e apresentou maior variação de intensidade de cor para amostra de saliva humana de indivíduo infectado por H. pylori, indicando que é possível utilizar um método simples, rápido e de baixo custo para auxiliar no diagnóstico de infecção de bactérias ureolíticas como H. pylori.