Avaliação da atividade e da inibição de ureases: estudos biofísicos de interação e desenvolvimento de metodologias analíticas
| dc.contributor.advisor1 | Santos, Josué Carinhanha Caldas | |
| dc.contributor.advisor1Lattes | http://lattes.cnpq.br/3735618604163061 | |
| dc.contributor.referee1 | Carrilho, Emanuel | |
| dc.contributor.referee1Lattes | http://lattes.cnpq.br/9157872297410868 | |
| dc.contributor.referee2 | Santana, Rodolfo de Melo Magalhães | |
| dc.contributor.referee2Lattes | http://lattes.cnpq.br/2427465793815991 | |
| dc.contributor.referee3 | Cunha, Silvio do Desterro | |
| dc.contributor.referee3Lattes | http://lattes.cnpq.br/5661286013847300 | |
| dc.contributor.referee4 | Goulart, Marilia Oliveira Fonseca | |
| dc.contributor.referee4Lattes | http://lattes.cnpq.br/5271094336884473 | |
| dc.creator | Tavares, Maria Celia | |
| dc.creator.Lattes | http://lattes.cnpq.br/1423242026697879 | |
| dc.date.accessioned | 2025-03-21T12:26:40Z | |
| dc.date.available | 2025-03-21T12:26:40Z | |
| dc.date.issued | 2022-12-19 | |
| dc.description.abstract | Urease catalyzes the hydrolysis of urea in NH3(g) and CO2(g); it is associated with problems in agriculture, such as reduced efficiency of urea fertilizer, and health, because it provides a microenvironment favorable to the colonization of the human stomach by H. pylori bacteria. Therefore, inhibiting and determining urease activity in different matrices is important. Thus, the main objective is to evaluate the mechanism of urease inhibition by organic compounds (natural and synthetic) using biophysical studies, as well as the development of methodologies to determine the activity of ureases in soils and saliva (synthetic and human), in addition to evaluating potential inhibitors. For the interaction between urease and natural isothiocyanate (MFC), an IC50 = 487 µM was obtained, and the compound was classified as a mixed inhibitor. The synchronized fluorescence assays corroborated the nature of the inhibition process. Spectroscopic studies indicated conformational changes in the enzyme resulting from the MFCurease interaction, with a binding constant (Kb) equal to 1.80 × 102 L mol-1 and stoichiometry 1: 1. In addition, the formation of the corresponding dithiocarbamates and thioureas has been proven after the reaction of the MFC with amino acids containing thiol and amine/guanidine groups. Thus, the urease's inhibition mechanism by MFC occurred through covalent and noncovalent interactions. MFC was more effective in soil microbiota than in vitro, with inhibition equivalent to NBPT for the two soils evaluated. For the interaction of urease with five benzoylthioureas, a direct relationship was found with the size of the N-alkyl substituent with the IC50 (M) and Kb values. It was found that BTU1 was the most active and, therefore, selected for biophysical studies in soils with urease. For the BTU1-urease complex, Kb was on the order of 103 L mol-1 at the different temperatures evaluated; based on thermodynamic studies, the preferred forces for stabilizing the supramolecular complex were hydrogen bonds and van der Waal forces. Synchronized fluorescence and competition assay studies indicate that BTU1 probably has classic mixed inhibitor behavior. In the different soils evaluated, BTU1 showed an inhibition potential equivalent to NBPT, emphasizing the importance of in vitro assays and application in a real sample for selecting a potential inhibitor. Two analytical paper devices (UrePAD and Multicolor PAD) were developed to determine urease activity in soils, saliva, and in the absence/presence of inhibitors. UrePAD is based on the color change of the acid-base indicator phenol red, exploring the change in pH due to the hydrolysis of urea by urease. The Multicolor PAD is also a colorimetric device employing five acid-base indicators (phenol red, bromothymol blue, bromocresol purple, m-cresol purple, and neutral red) and surface-modified polyelectrolyte poly-4-styrene sulfonate paper. sodium or polyvinylpyrrolidone. The images obtained were digitalized in a bench scanner, and the analysis was performed in the Corel Draw X8 software. The methods showed a mean LOD of 0.10 U mL-1 with linearity between 0.25 and 4.0 U mL-1. Both devices were applied to determine urease activity in four soil samples with different characteristics and in vitro evaluation of classic inhibitors. The results obtained did not differ statistically (95% confidence) from the reference method of indophenol blue, having as advantages the low cost, reduced volume of reagents/sample combined with simplicity and portability, showing the ability to simplify the determination of the activity of the urease in soils and the evaluation of potential inhibitors. Finally, the Multicolor PAD was applied to determine urease in a sample of synthetic and human saliva, with quantitative recoveries (between 80 - 120%) and to show a more significant variation in color intensity for a human saliva sample from an individual infected with H. pylori. Thus, it is possible to use a simple, fast, low-cost method to diagnose infection by ureolytic bacteria such as H. pylori. | |
| dc.description.resumo | A urease catalisa a hidrólise da ureia em NH3(g) e CO2(g), e está associada a problemas na agricultura como redução da eficiência do fertilizante ureia, e na saúde, pois proporciona um microambiente favorável à colonização do estômago humano pela bactéria H. pylori. Logo, é importante inibir e determinar a atividade da urease em diferentes matrizes. Assim, esse trabalho tem como objetivo principal avaliar o mecanismo de inibição da urease por compostos orgânicos (naturais e sintéticos) empregando estudos biofísicos, bem como desenvolver metodologias para a determinar a atividade das ureases de solos e saliva (sintética e humana), além de avaliar potenciais inibidores. Para o trabalho de interação da urease com isotiocianato natural (MFC) foi obtido IC50 = 487 M e classificação de inibidor misto pelo ensaio de cinética clássica e de fluorescência sincronizada. Estudos espectroscópicos indicaram alterações conformacionais da enzima decorrentes da interação MFC-urease, com constante de ligação (Kb) igual a 1,80×102 L mol-1 e estequiometria 1:1. Além disso, foi comprovado a formação de ditiocarbamatos e tioureias correspondentes após a reação do MFC com aminoácidos contendo grupos tiol e amina/guanidina. Assim, o mecanismo de inibição da urease pelo MFC ocorreu por meio de interações covalentes e não-covalentes. O MFC foi mais efetivo na microbiota do solo do que in vitro, com inibição equivalente ao NBPT para os solos avaliados. Para a interação da urease com cinco benzoiltioureias, foi constatado relação direta com o tamanho da cadeia do substituinte N-alquílica com os valores de IC50 (M) e Kb. Verificou-se que a BTU1 foi o composto mais ativo e, por isso, selecionada para estudos biofísico e em solos com a urease. Para o complexo BTU1-urease, Kb foi na ordem de 103 L mol-1 nas diferentes temperaturas avaliadas; baseado nos estudos termodinâmicos a estabilização do complexo urease-BTU1 é preferencialmente por ligações de hidrogênio e forças de van der Waals. Os estudos de fluorescência sincronizada e ensaio de competição indicaram comportamento clássico de inibidor misto para BTU1. Nos diferentes solos avaliados, BTU1 apresentou potencial de inibição equivalente ao NBPT ressaltando a importância de ensaios in vitro e aplicação em amostra real para a seleção de um potencial inibidor. Além disso, foram desenvolvidos dois dispositivos analíticos em papel (UrePAD e Multicolor PAD) para determinar a atividade da urease em solos, saliva e na avaliação de inibidores. O UrePAD é baseado na mudança de cor do indicador ácido-base vermelho de fenol, em função do aumento do pH pela hidrólise da ureia pela urease. O Multicolor PAD também é um dispositivo colorimétrico, no qual foram avaliados cinco indicadores ácido-base (vermelho de fenol, azul de bromotimol, roxo de bromocresol, roxo de m-cresol e vermelho neutro) e papel com superfície modificada por polieletrólito poli- 4-estireno sulfonato de sódio ou polivinilpirrolidona. As imagens obtidas foram digitalizadas em um scanner de bancada, e a análise realizada no software Corel Draw X8. Os métodos apresentaram LOD médio de 0,10 U mL-1 com linearidade entre 0,25 e 4,0 U mL-1. Ambos os dispositivos foram aplicados na determinação da atividade da urease em quatro amostras de solos com diferentes características e avaliação in vitro de inibidores clássicos. Os resultados obtidos não diferiram estatisticamente (95% de confiança) do método de referência do azul de indofenol, tendo como vantagens o baixo custo, reduzido volume dos reagentes/amostra aliado à simplicidade e portabilidade, mostrando a capacidade de simplificar a determinação da atividade da urease em solos e a avaliação de potenciais inibidores. Por fim, o Multicolor PAD foi aplicado para determinar urease em amostra de saliva sintética e saliva humana, com recuperações quantitativas (ente 80 – 120%) e apresentou maior variação de intensidade de cor para amostra de saliva humana de indivíduo infectado por H. pylori, indicando que é possível utilizar um método simples, rápido e de baixo custo para auxiliar no diagnóstico de infecção de bactérias ureolíticas como H. pylori. | |
| dc.identifier.uri | https://repositorio.ifal.edu.br/handle/123456789/904 | |
| dc.language.iso | pt | |
| dc.publisher.country | Brasil | |
| dc.publisher.department | Campus Batalha | |
| dc.subject | Urease | |
| dc.subject | Inibidores de urease | |
| dc.subject | Urease – Interação | |
| dc.subject | Benzilisotiocianato | |
| dc.subject | Benzoiltioureias | |
| dc.subject | Colorimetria | |
| dc.subject | UrePAD | |
| dc.subject | Multicolor PAD | |
| dc.subject | Indofenol | |
| dc.subject | Benzylisothiocyanate | |
| dc.subject | Benzoylthiourea | |
| dc.subject | Colorimetry | |
| dc.subject | Indophenol | |
| dc.subject.cnpq | CIENCIAS EXATAS E DA TERRA | |
| dc.title | Avaliação da atividade e da inibição de ureases: estudos biofísicos de interação e desenvolvimento de metodologias analíticas | |
| dc.type | Tese |